SUBKLONING GEN α-L-ARABINOFURANOSIDASE (abfA) DALAM VEKTOR EKSPRESI pYES2
ABSTRAK: Gen pengkode
-L-arabinofuranosidase
(abfA) yang telah
dikloning dalam E.
coli DH5a/pTP510 rekombinan disubkloning
ke sistem ragi
Saccharomyces cerevisiae. Subkloning
gen abfA ke
dalam S. cerevisiae bertujuan untuk ekspresi enzim -L-arabinofuranosidase
(AbfA) termostabil dalam sel inang yang sering diistilahkan sebagai Generally
Recognized As Safe
(GRAS), sehingga enzim
ini dapat diaplikasikan
lebih luas seperti
dalam industri makanan dan minuman. Gen abfA disubkloning dengan cara
amplifikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) dari templet
plasmid pTP510. Sepasang
gen primer pFSacI-Af
(forward) dan pXhoI-Af
(reverse) yang merupakan hasil disain dari penelitian ini
digunakan untuk amplifikasi. Kondisi PCR dilakukan sebagai berikut: denaturasi awal pada 94oC
selama5 menit; siklus
PCR 30 kali
yang terdiri dari
denaturasi (94oC selama
1 menit), annealing
(55oC selama 30 detik), dan polimerisasi/ekstensi 72oC selama 2 menit;
serta ekstensi akhir 72oC selama 7 menit.
Gen abfA hasil amplifikasi disisipkan di antara promotor GAL1 dan
terminator CYT1 dalam vektor ekspresi ragi pYES2. Hasil ligasi ini
ditransformasikan ke dalam
sel inang E.
coli TOP10. Analisis
restriksi plasmid rekombinan
dari hasil konstruksi ini, yang
dinamakan plasmid pY-Af, menunjukkan ukuran yang sesuai, sekitar 7,4 kb, yang
sudah sesuai dengan penjumlahan ukuran plasmid induk (5,9 kb) dan fragmen DNA
sisipan (1,5 kb).
Kata kunci: -L-arabinofuranosidase; Saccharomyces
cerevisiae; subkloning, vektor
ekspresi; Polymerase Chain Reaction
Penulis: I Nengah Wirajana,
Eddy Bagus Wasito
Kode Jurnal: jpkimiadd100230
